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腾博会官网临床前大动物实验中心
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摘要：心脏毒性仍然是药物研发失败的最常见缘故原由。最近用于评估药物依赖性心脏毒性和识别心脏�；し肿拥陌呗碛隳Ｗ右丫浩�。然而，基于斑马鱼的效果在多洪流平上可以实现人类转化仍然未知。 为相识决这个问题，我们建设了多柔比星、肾上腺素和特非那定诱导的心脏毒性的胚胎斑马鱼模子，接纳统一的给药计划实现了药物的系统较量。随后，我们确定了人类心脏�；ひ┪铩依鬃羯⒚劳新宥⒖ㄎ芈搴顽由程埂欠衲芄恢瘟瓢呗碛愕男脑喙πд习�。腾博会官网研究效果批注，多柔比星、肾上腺素和特非那定在鱼类中引起了显着的心脏毒性迹象，进一步批注阻断肾素-血管主要素系统以及在较小水平上阻断 β-肾上腺素能系统，改善了斑马鱼的心脏病。从药物开发的角度来看，腾博会官网事情开启了使用快速且经济实惠的斑马鱼模子确定测试化合物的心血管特征的可能性。
要害词：人类疾病 药物筛选 儿茶酚胺 β-肾上腺素能系统 β受体阻滞剂 血管主要素受体阻滞剂
简介：心血管疾病是全球发病率和殒命率的主要缘故原由。只管心脏药物已被证实可有用预防和治疗心脏功效障碍，但仍在起劲寻找刷新的疗法。心脏毒性仍然是药物开发历程中失败的最常见缘故原由。现在用于筛选候选药物不良心脏症状的战略包括体外心肌细胞剖析和动物模子的使用。只管前者可以快速筛查心脏毒性，但它不可反应整个生物体的影响。相反，基于动物的要领允许更详细地表征心脏毒性，但由于腾贵且耗时的测定，它们的普遍使用受到限制。因此，开发一个既能降低本钱又能坚持试验质量的模子系统关于药物开发项目的乐成至关主要。最近，斑马鱼已成为心血管研究中的一种有价值的工具。纵然在胚胎阶段，光学透明度和快速生长也可以使个体动物的循环系统可视化。只管斑马鱼和人类之间的心脏剖解结构保存显着差别，但一些心理相似性可能使斑马鱼优于常用的啮齿动物模子。例如，斑马鱼的心跳速率在 120 到 180 次/分之间。这与在康健人中视察到的约莫 70 次/分钟的静息心率相当。 啮齿动物在这方面有很大差别，例如。 鼠心率凌驾300次/分，大鼠心率规模为250～493次/分。别的，鱼类血管形成的剖解学和分子机制与在人类和其他高等脊椎动物中视察到的相似。斑马鱼有一个关闭的循环系统，其中血液循环早在受精后 24 小时 (hpf) 就最先了。72 hpf 完成血管的生长 ， 背自动脉是贯串整个躯干的主要胚胎动脉，在胚胎阶段最先血流并逐渐增添速率。迄今为止，斑马鱼胚胎已被用于药物依赖性心脏毒性的评估和心脏�；し肿拥呐卸�。β-肾上腺素能受体（βAR）激动剂（如肾上腺素）、多柔比星和特非那定体现出差别的心脏毒性模式。慢性βAR刺激启动受体的下调，从而抑制心律和心脏缩短�；钚匝酰≧OS）的爆发和心肌细胞殒命的诱导被以为是多柔比星损伤心肌引起危及生命的心肌病的机制。特非那定是一种停用的抗组胺药，可导致QT间期延伸，从而导致心律失常。所有这些药物的心脏毒性特征已在啮齿动物模子和人类患者中举行了彻底研究。然而，斑马鱼心脏怎样对这些众所周知的心脏毒性化合物作出反应仍然未知。 据我们所知，这是第一次在斑马鱼模子中对药物依赖性心脏毒性特征举行正面验证。 这种平行较量关于将斑马鱼数据进一步临床转化至关主要。为相识决这个问题，我们建设了多柔比星、肾上腺素和特非那定诱导的心脏毒性的胚胎斑马鱼模子，并通过功效和形态学改变对其举行了表征。随后，我们确定了心脏�；ひ┪铩依鬃羯⒚劳新宥⒖ㄎ芈搴顽由程埂欠衲芄豢刂瓢呗碛愕男脑喙πд习�。多柔比星、肾上腺素和特非那定的平行较量显示了化合物特异性的心脏毒性作用，突出了它们差别的作用方法。 进一步的剖析批注，β-肾上腺素能和血管主要素受体拮抗剂可减轻受损的心血管参数。效果证实了斑马鱼模子捕获药物心脏毒性和心脏�；ぬ卣鞯目尚行�。从药物开发的角度来看，腾博会官网事情为使用快速且价钱合理的斑马鱼模子展望受试化合物的心血管特征提供了可能性。
阴性比照组和溶剂比照组的殒命率和自觉性畸形不凌驾10%。为了诱导应用多柔比星、肾上腺素和特非那定的心脏毒性模子，将24 hpf 到 96 hpf 斑马鱼胚胎袒露于化合物 (toxCOI)。心脏�；せ衔铮╬rotectCOI），即美托洛尔、卡维地洛、缬沙坦和右雷佐生，在心脏毒性化合物（即22 hpf、46 hpf和70 hpf）泛起前两小时使用。凭证腾博会官网剂量规模研究和文献数据选择受试心脏�；せ衔锏呐ǘ�。美托洛尔最小抑制心率浓度为250??M和次有用浓度为100??M和50??M�？ㄎ芈逖≡� 25、10 和 5 μM 的等效剂量。缬沙坦选择 200 ?M、80 ?M 和 40 ?M 的非抑制性心率浓度。凭证文献数据，选择了 200 ?M 和 800 ?M 剂量的右雷佐生，并验证它们是无毒的。由于温度和噪声的转变，可以视察到实验之间的一定转变。 所选浓度的所有四种心脏�；せ衔锞换岬贾麻婷蚍⒂郝�。
多柔比星诱导的心脏毒性：多柔比星的心脏毒性在人类和动物模子中获得了很好的表征。我们举行了起源的剂量和时间规模研究，以优化治疗计划，以实现多柔比星诱导的心脏毒性的可重复生长。在第一次孵育 (hpi) 后，在很宽的浓度规模内 (50–150 ?M) 多柔比星直至 48 h 都没有引起殒命。在72 hpi时多柔比星诱导的殒命率变得显着，50%致死浓度（LC50）值为104??M。不早于 48 hpi 在至少 70 ?M 的浓度下视察到心率抑制。在 72 hpi，抑制心率的最高非致死浓度即是 70 ?M。比照组和多柔比星治疗组斑马鱼心率的平均绝对差别为-19.97 bpm。除心率抑制外，多柔比星在 72 hpi 导致心脏异常的浓度依赖性生长。 在 70 ?M 剂量 (72 hpi) 时，三分之一的袒露仔鱼检测到异常。结构和功效异常包括：心包水肿 (PE)、心脏牵张和血管内缺乏血液循环。别的，多柔比星在大宗微血管的区域引起严重出血（HE）。由于多柔比星具有荧光，因此我们可以确定其在胃肠道中的漫衍。于没有殒命率、显著的心率抑制和结构性心脏异常的保存，选择 70 μM 的剂量与假定的心脏�；ひ┪锿沤嶂瘟凭傩薪徊狡拦�。
图1、斑马鱼仔鱼心血管效应评估
图2、多柔比星对斑马鱼的毒性和活性。多柔比星对斑马鱼殒命率（A）、心率（B）和形态（C-E）的影响。
肾上腺素诱导的心脏毒性：儿茶酚胺水平过高的心脏毒性效应已在实验模子和人类心脏中获得充分证实。其中一种内源性儿茶酚胺是肾上腺素——一种肾上腺素能受体的强效刺激剂。因此，我们决议探索肾上腺素袒露对斑马鱼心脏的影响。从 250 ?M 最先，肾上腺素以剂量依赖性方法增强心脏功效，模拟其对人体心脏的短效活性。在稍后的时间点，这种效应会导致心率降低。 由于这种抑制作用，在 48 hpi 时恢复到基线。在 72 hpi 时，从 500 ?M 的肾上腺素中检测到显着的心动过缓。 进一步增添剂量会爆发严重的心动过缓，在 1000 ?M 时抵达 ‐19.80 bpm。在这个浓度规模内，肾上腺素在任何时间点都不会诱发任何形态异常。为了进一步研究，选择了 1000 ?M 的心脏抑制剂量。
图 3、肾上腺素对斑马鱼的毒性和活性。
特非那定诱导的心脏毒性：由于特非那定是众所周知的心脏毒性物质，我们确定它是否反应了斑马鱼仔鱼的类似毒性。在这里，特非那定显示出高毒性，划分在48hpi和72hpi下导致LC50划分为50?μM和39?μM。特非那定从24小时最先以浓度依赖性方法降低心率。以后在 72 hpi 视察到5 ?M 到 25 ?M 的心率抑制。袒露于特非那定后，斑马鱼在 72 hpi 的浓度低至 10 ?M 时体现出普遍的心脏异常（概率为 32%）。显微镜检查显示除心包水肿（PE）外，心室塌陷。当特非那定浓度高于 20 ?M 时，检测到心脏和严重的身体畸形，即头部 (HM) 和尾部改变 (TM) 和卵黄囊水肿 (YSE)。因此，为了进一步研究，选择了 10 μM 的非致死浓度，由于它的心脏抑制作用爆发时没有可检测到的严重畸形。
图 4 特非那定对斑马鱼的毒性和活性。
心脏毒性模子对心脏功效转变的较量：为了进一步验证袒露于所提出的心脏毒性化合物是否会导致心理性心脏功效和结构缺陷的损害，评估了缩短分数、每搏输出量和心输出量。缩短分数从比照动物的 18.50% 显著降低到多柔比星处置惩罚的鱼的 9.76%，批注心室缩短力削弱。我们剖析了每搏输出量参数，该参数是指每次心跳后从心室泵出的血液量。 与比照相比，多柔比星显著镌汰每搏输出量约 0.14 nL。除了缩短力降低之外，多柔比星处置惩罚的鱼的心脏似乎反应了心脏泵血的不规则方法，即心输出量的改变，这可能批注心肌有缺陷或心力衰竭的症状。心脏功效评估归纳综合了肾上腺素不影响任何显着的表型心脏异常。下一个测试的心脏毒性化合物 - 特非那定 - 增添了心脏的每搏输出量，批注心脏泵血越发有力或泵血量增添。 该效果与心率抑制有关，而缩短分数未改变。我们推测，随着心率一连下降，每搏输出量会因充裕时间增添而增添。 因此，心输出量坚持稳固，由于降低的心率被增添的每搏输出量所赔偿。我们较量了所提出的模子与心率的转变，划分丈量心脏心房和心室的搏动次数。在测试的化合物中，只有特非那定引起了促心律失常作用，体现为心房早博或特殊搏动。 多柔比星消除了心脏缩短的能力和纪律的节律，因此抵消了每搏输出量和心输出量。肾上腺素仅降低心率，而特非那定引起的心动过缓可赔偿每搏输出量的增添。图5D显示了全心脏毒性化合物或溶媒比照处置惩罚的mnx1:dsRed转基因斑马鱼仔鱼的形态缺陷。多柔比星导致心脏拉长，袒露于特非那定 72 小时后，视察到心室稍微变形。
图 5. 心脏毒性模子对心脏功效转变的较量。
多柔比星具有促氧化作用，而特非那定诱导斑马鱼仔鱼凋亡：ROS诱导的氧化应激是引起心脏毒性的主要因素之一，导致细胞凋亡殒命。有鉴于此，我们举行了一组实验，以提供对斑马鱼模子中多柔比星、肾上腺素和特非那定毒性的机制洞察。如图6A所示，与比照组相比，仅多柔比星处置惩罚的斑马鱼的ROS水平显著升高。陪同着在荧鲜明微镜下视察斑马鱼仔鱼，发明心脏区域的荧光强度更高。因此，效果证实了多柔比星提高斑马鱼 ROS 天生的能力。 形成鲜明比照的是，与比照相比，多柔比星治疗不影响程序性细胞殒命，肾上腺素在动物中既不引起活性氧的爆发也不引起细胞凋亡。下一个评估模子—特非那定—对活性氧的爆发没有影响，可是吖啶橙染色显示，它诱导心脏区域的细胞殒命。效果批注，特非那定诱导的细胞凋亡不归因于ROS的形成。
图6、活性氧天生和凋亡的检测。
评估化学诱导的心脏�；ぷ饔茫喝缟纤�，斑马鱼袒露于之前在人类和啮齿类动物模子中被证实具有心脏毒性的药物后泛起心脏功效障碍。为了进一步验证斑马鱼作为心血管研究药理学模子的可用性，我们旨在验证用于减轻人类心脏功效障碍的药物的心脏�；せ钚允欠窨梢栽诎呗碛阒懈粗�。这三种药物是凭证其治疗特点选择的：美托洛尔（选择性β1-肾上腺素能受体拮抗剂）、卡维地洛（具有重大药理学特征的α1-和β-受体阻滞剂）和缬沙坦（血管主要素受体阻滞剂）。这些药物通常用于治疗高血压、心力衰竭、心律失常和心肌病。在多柔比星诱导的毒性配景下，研究了右雷佐生的特征，这是唯逐一种临床批准的用于基于蒽环类药物的抗癌治疗的心脏�；ぜ�。评估了美托洛尔、卡维地洛和缬沙坦对多柔比星、肾上腺素和特非那定诱导的心脏毒性的心脏�；せ钚�。
右雷佐生—唯一经临床批准的基于多柔比星的心脏毒性药物—对斑马鱼仔鱼有用：早在 24 hpi 时，右雷佐生在 200 ?M 和 800 ?M 两种测试剂量下都能削弱多柔比星诱导的心率抑制。在 200 μM 的剂量下，在 48 hpi 时也发明了�；せ钚�，可是，在 72 hpi 时效果并未维持。只管右雷佐生不可缓解多柔比星引起的血流障碍，但它能够逆转多柔比星引起的血管缩短。别的，与单独使用多柔比星相比，用右雷佐生团结治疗的斑马鱼的心脏异常水平要小得多。因此，已显示给予右雷佐生可改善多柔比星相关的心脏功效障碍。
图 7. 右雷佐生对多柔比星诱导的心脏毒性的心脏�；ぷ饔�。
美托洛尔对多柔比星诱导的心脏毒性没有影响：单用多柔比星可显著降低心率，美托洛尔不可逆转这种作用。在 72 hpi 时，在多柔比星处置惩罚的斑马鱼中视察到进一步的心率抑制，多柔比星与美托洛尔配合处置惩罚甚至加剧了这种效果，在 250 ?M 美托洛尔与单用多柔比星相比， 多柔比星诱导的心动过缓与血流镌汰和背自动脉缩短有关。在这两种情形下，美托洛尔都无法改善这些影响。美托洛尔并不可阻止多柔比星对心脏的显着改变，这证实了美托洛尔不可预防多柔比星引起的心脏毒性。
图 8. 对多柔比星诱导的心脏毒性的心脏�；ぷ饔�。
卡维地洛仅减轻多柔比星诱导的血管缩短：多柔比星和卡维地洛的配合治疗加剧了多柔比星诱导的心率抑制，尤其是在 72 hpi�？ㄎ芈迕挥懈纳蒲魇芩�，但它能够逆转多柔比星引起的血管缩短。单独使用多柔比星会导致心脏异常，例如心包水肿和心脏拉长，卡维地洛甚至以显着的浓度依赖性方法增强了这种作用。因此，卡维地洛不可预防多柔比星引起的心脏毒性。
β-肾上腺素能系统对斑马鱼仔鱼的药理反应是守旧的：美托洛尔和卡维地洛属于竞争性β-肾上腺素受体拮抗剂，可阻断内源性儿茶酚胺——肾上腺素和去甲肾上腺素。在这里，两种β受体阻滞剂都能逐渐逆转在24 hpi时视察到的肾上腺素诱发的心动过速。进一步袒露于肾上腺素导致心率和血流量在72 hpi时下降。只管美托洛尔和卡维地洛都增强了肾上腺素引起的心率抑制，但这些药物显著改善了肾上腺素引起的血流量镌汰。所有测试的 β-肾上腺素能配体均不影响背自动脉的直径。
图 9. 对肾上腺素诱导的心脏毒性的心脏�；ぷ饔�。
缬沙坦完全减轻特非那定引起的心脏毒性：美托洛尔在治疗特非那定引起的心律失常、血流和血管缩短方面的心脏毒性方面没有显著改善。别的，特非那定单独使用时，患有心脏异常的斑马鱼仔鱼的比例相当高，与美托洛尔团结使用并不可以显着的剂量依赖性方法改善这种效果。下一个评估的药物——卡维地洛——甚至在 72 hpi 时加剧了特非那定诱导的心动过缓的心率下降。只管卡维地洛在控制血流受损方面失败，但它消除了血管缩短，并略微降低了由特非那定引起的心脏异常的爆发频率。因此，与美托洛尔相比，卡维地洛在改善特非那定心脏毒性方面更有用。有趣的是，缬沙坦在所有时间点逐渐改善心动过缓，与 72 hpi 单独使用特非那定相比，在 200 ?M 时心率甚至增添约 +19 bpm。缬沙坦改善了受损的血流，并且与背自动脉扩张相吻合。
图10、特非那定引起的心脏毒性的心脏�；ぷ饔�。
在这项研究中，我们周全评估了斑马鱼心脏毒性和心脏�；さ囊├砟Ｗ�，腾博会官网效果批注：多柔比星、肾上腺素和特非那定在鱼类中引起显着的心脏毒性迹象；多柔比星引起心肌损伤，肾上腺素袒露导致最初的心动过速，随后心率下降，而特非那定引起促心律失常；袒露于多柔比星和特非那定划分导致 ROS 太过爆发和细胞凋亡；阻断肾素-血管主要素系统，以及在较小水平上阻断β-肾上腺素能系统，改善了斑马鱼药物依赖性心脏功效障碍；斑马鱼模子反应了β-肾上腺素能和血管主要素系统的药理学反应。事情的要害新颖方面是对斑马鱼中三个特征明确的心脏毒性模子举行平行较量和验证。别的，我们设计了一种要领，可以在药物开发的早期阶段评估心血管效应。 我们获得的效果批注斑马鱼仔鱼可以体现出心脏毒性的基本症状，因此适用于大规模测试化合物对心脏的影响。这里开发的计划快速（只有三天的时间举行完整评估），本钱效益高，适用于自动化高通量心血管筛查。综上所述，这些实验的效果为斑马鱼对心血管药物的功效性反应提供了看法，斑马鱼模拟了人类的反应，因此支持斑马鱼模子在心血管疾病研究中的价值。
原文出自：Pharmacological assessment of zebrafish-based cardiotoxicity models - ScienceDirect
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