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摘要：N-异丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）是天下规模内普遍使用的抗氧化剂，是轮胎橡胶中的添加剂，容易排放到周围情形中 。现在，尚未有关于IPPD对鱼类亚急性毒性的研究 。使用斑马鱼胚胎（受精后2小时）袒露于0、0.0012、0.0120和0.1200 mg/L的浓度的IPPD 5天以研究其对胚胎发育、生长激素/胰岛素样生长因子（GH/IGF）和下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的破损的毒性效应 。效果批注，IPPD袒露降低了斑马鱼的孵化率，削弱了运动能力，镌汰体长，并导致斑马鱼胚胎泛起多种畸形 。斑马鱼幼体袒露于IPPD后，GH/IGF和HPT轴相关基因的表达爆发改变 。同时，IPPD显著降低了仔鱼体内甲状腺素（T4）和3,5,3′-三碘甲状腺原氨酸（T3）的含量，批注HPT轴处于杂乱状态 。别的，IPPD 的治疗降低了超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 的酶活性以及谷胱甘肽 (GSH) 的水平 。而袒露于IPPD后丙二醛（MDA）的含量升高 。本研究批注，IPPD诱导氧化应激，引起发育毒性，并破损斑马鱼的GH/IGF和HPT轴，这可能导致发育障碍和生长抑制 。
要害词：斑马鱼 IPPD 生长激素/胰岛素样生长因子（GH/IGF）轴 下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴 氧化应激
简介：橡胶抗氧剂是添加到橡胶及其制品中的一种添加剂，具有抑制氧化、耐热或耐光、避免老化的作用，从而延伸制品的贮存期和使用寿命 。由于轮胎的磨损，这些抗氧化剂及其化合物很容易随路面雨水释放到水体中 。相关研究报告称，当银鲑向上游迁徙并产卵时，每年有90%的鲑鱼突然殒命 。若是恰巧遇到大雨，它会加速鲑鱼的殒命时间，大宗鲑鱼将在短短几个小时内殒命 。研究职员以为，这与轮胎生产历程中添加的抗氧剂6PPD爆发的化合物N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺(6PPD)-醌亲近相关 。凭证差别的标准，橡胶抗氧剂可以分为差别的种类，其中芳香族仲胺（Ar-SAs）是最常用的一种 。就化学结构的转变而言，Ar SA可分为取代二苯胺（S-DPAs）和取代对苯二胺（S-PPD） 。后者是橡胶工业中最有用和最常用的抗氧化剂和抗臭氧剂 。N-异丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）和6PPD都是抗氧化剂的芳香族仲胺（Ar-SAs），也是使用最普遍的轮胎抗氧化剂 。橡胶释放到废水中是很是令人担心的，由于水载污染物会影响人类和动物的康健以及腾博会官网自然生态系统 。IPPD用作橡胶中的抗氧化剂，主要用于汽车轮胎，天下上IPPD的年产量为10000–15000吨 。IPPD 的 log 辛醇-水分派系数 (log Kow) 值为 3.88，在2～16h的差别纯度水中测定了IPPD的半衰期值 。很少有研究关注IPPD的毒性，其在情形中的水平尚不清晰 。迄今为止，有关 IPPD 毒性的信息很少见 。 没有关于人类急性吸入或口服袒露IPPD后影响的数据 。在两项简要报告的研究中，大鼠经口IPPD途径具有中等毒性，而家兔经皮途径具有极低毒性 。IPPD是动物和人类的皮肤致敏剂 。体外哺乳动物细胞诱变试验批注，IPPD具有诱发染色体畸变的潜力 。凭证急性毒性效果，虹鳟鱼和黑头鲦鱼的 96 h 致死浓度 50 (LC50) 为 0.34 至 0.43 mg/L 。并且没有关于 IPPD 对鱼类的亚急性影响的信息 。 IPPD是否对水生生物有显着的发育毒性尚不清晰 。虽然生长和发育是重大的遗传和分子相互作用的效果，因此是种种因素的组合，但鱼类的险些所有主要心理历程，包括能量平衡、免疫功效、滋生以及主要生长，都受生长激素和生长激素/胰岛素样生长因子（GH/IGF）轴的调理 。因此，生长激素/胰岛素样生长因子轴作为鱼类生长的要害神经内渗透调理因子引起了普遍关注 。别的，甲状腺激素（THs）在体细胞生长、发育、代谢、孵化后失常和行为控制中起着至关主要的作用 。甲状腺激素的合成、渗透、运输和代谢受下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的调理 。众所周知，没有康健的心理功效，鱼就无法生长 。 含有抗氧化酶和非酶抗氧化剂的抗氧化防御系统对鱼类的生长性能也起着主要作用 。在这项研究中，斑马鱼胚胎袒露于差别浓度的 IPPD 以视察发育和生长毒性 。 定量测定主要影响生长发育的GH/IGF和HPT轴所涉及的激素和基因表达的转变 。并检测到加入抗氧化防御系统的抗氧化酶 。 本研究的目的是研究斑马鱼抗氧化防御系统、GH/IGF 和 HPT 轴对 IPPD 袒露的反应机制 。
发育毒性：IPPD 对斑马鱼的 96 小时 LC50 为 1.2 mg/L，95% 置信区间为 0.9-1.5 mg/L，凭证全球化学分类和标签协调手册 (GHS) 分类标准，IPPD 对斑马鱼具有剧毒 。三个袒露组的孵化率均下降，0.1200 mg/L处置惩罚组的孵化率比比照组低39.76% 。
图1、袒露于 IPPD (0, 0.0012, 0.0120 和 0.1200?mg/L) 的斑马鱼（a） 48?h的孵化率、(b) 60 秒内自主运动、(c) 120?h胚胎的体长 。
与比照组相比，所有 IPPD 治疗组的自觉运动均显著降低，0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L 治疗组的自觉运动划分降低了 28.5%、31.17% 和 68.5% 。袒露120?h后，0、0.0012、0.0120和0.1200?mg/L的平均体长划分为4.15（?±?0.16）、4.02（?±?0.16）、3.85（?±?0.10）和3.75（?±?0.06）mm 。袒露于 0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 后视察到显著下降 。纪录了IPPD引发斑马鱼幼体的畸形 。与比照组相比，所有治疗组均视察到典范畸形，包括弯尾畸形（BT）、脊柱弯曲畸形（BS）和卵黄囊肿（VC） 。别的，视察批注，畸形可能以一种形式泛起，也可能同时以多种形式泛起 。
GH/IGF 轴上的基因转录谱：袒露于IPPD后，gh的转录水平（1.13、1.11和1.04倍）没有显著转变 。同样，经IPPD处置惩罚后，ghrh的表达也没有显著转变 。ghra 基因表达水平（0.77、0.91 和 0.57 倍）在 0.0012 和 0.1200?mg/L 处置惩罚组中下调，而 ghrb（1.68、1.58 和 1.09 倍）在 0.0012 和 0.0120?mg/L 袒露组中显著上调 。
图 2、 斑马鱼胚胎袒露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 下 96?h 的 GH/IGF 轴相关基因的 mRNA 表达谱 。
在三个IPPD袒露组中，igf1的表达（0.32、0.27和0.47倍）显著下调. 。同样，在三个IPPD袒露组中，igf1ra（0.09、0.09和0.25倍）和igf1rb（0.12、0.11和0.68倍）的表达也显著下调 。igf2a（1.17、1.00和0.68倍）和igf2b（1.15、1.07和0.57倍）的转录水平仅在0.1200?mg/L IPPD组中下调 。与 igf2a 和 igf2b 类似，igf2r 的转录水平（1.25、1.18 和 0.42 倍）仅在 0.1200?mg/L IPPD 组中下调 。igfbp1a（0.93、0.79和0.19倍）和igfbp1b（1.27、1.18和0.22倍）的转录水平仅在0.1200?mg/L处置惩罚组显著下调 。在三个IPPD袒露组中，igfbp2a（0.33、0.44和0.48倍）和igfbp6b（0.58、0.42和0.28倍）的转录水平显著下调 。igfbp5a的基因表达（0.89、1.42和1.19倍）仅在0.0120?mg/L IPPD组中上调 。 IPPD对igfbp7的表达无显著影响（1.09、1.26和1.23倍） 。
HPT轴基因转录谱：与比照组相比，所有袒露组的tshβ（0.69、0.59和0.53倍）和crh（0.64、0.52和0.37倍）基因均呈浓度依赖性下调 。
图 3 、斑马鱼胚胎袒露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L 的IPPD 96?h 时，HPT 轴相关基因的 mRNA 表达谱 。袒露于 0.0012?mg/L 和 0.1200?mg/L IPPD 显著上调 dio2 的表达（1.30、1.17 和 1.31 倍） 。同样，三个 IPPD 袒露组中，tr?α（0.54、0.49 和 0.38 倍）和 tr?β（0.55、0.46 和 0.40 倍）的表达显著下调 。
GH和IGF含量：与比照组相比，三个IPPD治疗组的GH激素水平显著降低 。同样，与比照组相比，袒露于IPPD显著降低IGF的激素水平 。仔鱼袒露120小时后丈量全身THs水平 。 各治疗组T3、T4总水平呈下降趋势 。同时，与比照组相比，所有袒露组的T3与T4比率均显著降低 。
图4、 袒露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑马鱼仔鱼GH（a）和IGF（b）激素水平
图5、（a） 甲状腺素（T4）含量；（b） 3,5,30-三碘甲状腺原氨酸（T3）含量；（c） 袒露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑马鱼仔鱼的T3/T4比值 。
氧化应激：袒露于 IPPD 会导致 MDA 和 GSH 水平以及 SOD 和 CAT 的酶活性爆发显著转变 。与比照组相比，所有治疗组的SOD活性均呈剂量依赖性下调，CAT活性均显著下调 。三个治疗组的MDA含量均有差别水平的升高 。 而0.0012和0.0120?mg/L组GSH含量较比照组降低 。
图 6. 袒露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 直至 120 hpf 的斑马鱼仔鱼 SOD (a)、CAT (b) 和 MDA (c)、GSH (d) 水平的转变 。
讨论：IPPD对生物体的毒性尚不清晰 。凭证几项简短的研究，IPPD对大鼠具有中等毒性，对家兔具有极低毒性 。IPPD是动物和人类的皮肤敏化剂，有可能诱发哺乳动物细胞染色体畸变 。凭证鱼类的急性毒性效果，IPPD对蓝鳃太阳鱼、虹鳟和黑头鲤具有高度毒性 。现在没有关于IPPD对鱼类亚急性影响的信息 。在本研究中，我们在实验室条件下评估了IPPD对斑马鱼胚胎-仔鱼生长发育阶段的影响 。对孵化率和体长有显著影响，这批注胚胎发育直接延迟 。自觉运动是肌肉和运动神经系统配合发育的效果，是评估化学品对鱼类毒性的主要毒理学终点 。我们还检测到仔鱼的自觉运动镌汰 。 因此，IPPD 袒露后自觉运动的浓度依赖性镌汰可能意味着由于 IPPD 潜在的神经发育毒性而导致的发育缓慢 。 需要进一步的视察来证实这一视察效果 。多种情形化学物质，如金属元素、纳米颗粒、长期性有机污染物、杀虫剂，均可诱发脊柱弯曲等骨骼异常 。脊柱畸形可能是由于康健肌肉骨骼系统发育所必需的肌节和/或肌球卵白形成镌汰所致 。在本研究中，IPPD引起的畸形可能是一种或多种机制的效果 。由于确定畸形的机制不是本研究的目的，因此需要进一步的研究来视察它们 。
袒露于IPPD的GH/IGF轴反应：在腾博会官网研究中，袒露于IPPD后，仔鱼的体长受到显著抑制，这批注IPPD影响了仔鱼的生长性能 。生长激素/胰岛素样生长因子轴在鱼类生长的内渗透调理中起主导作用 。初始阶段 GH/IGF 轴的任何缺陷都可能对鱼类的生长爆发永世性影响 。 这种在脊椎动物发育早期形成的重大生长系统主要由配体、受体和一些具有高亲和力的团结卵白组成 。GH/IGF 轴由配体（胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II）、受体（胰岛素样生长因子-IR、胰岛素样生长因子-ⅡR）和胰岛素样生长因子团结卵白（胰岛素样生长因子团结卵白）组成，以协调的方法调理险些所有细胞类型的增殖、分解和存活 。GH/IGF 轴在调理鱼类的体细胞生长和孵化后施展着至关主要的作用，被以为是情形污染物影响的指标 。我们检测了GH/IGF轴相关基因的表达 。生长激素通过与肝脏中的生长激素受体 (GHR) 团结来刺激 IGF 的合成和释放 。 斑马鱼有两种主要的 GHR（ghra 和 ghrb） 。gh 的表达影响两种特定受体（ghra 和 ghrb）的表达 。gh的表达没有显着转变，而ghra的表达显着下调 。 因此，ghrb的表达上调，以填补ghra的缺乏，维持受体的平衡 。生长激素释放激素（ghrh）是增进垂体渗透GH的最主要的神经内渗透因子 。 ghrh的表达没有显著转变，批注ghrh可能不增进gh的表达 。IGFs家族，包括IGFI和IGFII，是脊椎动物中进化上守旧的肽，通过守旧的信号通路施展作用 。斑马鱼基因组包括哺乳动物IGF2的两个同源物（igf2a和igf2b） 。这些IGFs加入细胞生长和代谢，IGFs的生物活性和生物使用度受IGFBPs调控 。IGFBPs对IGFs的亲和力高于对IGFRs的亲和力 。 IGFBP家族有6个成员，包括IGFBP1-IGFBP6 。 哺乳动物通常有六种 IGFBP，而其他一些物种则缺乏其中的一种或多种 。例如，鸡和斑马鱼没有 IGFBP 4 基因 。在腾博会官网研究中，IGFs（igf1、igf2a和igf2b）基因和IGF卵白水平以及IGFR（igf1ra、igfrb和igf2r）的下调可能是IGFBPs（igfbp2a、igfbp1a和igfbp6b）下调的效果 。IGFBPs通过影响IGF的转运而影响IGF的正常水平和心理功效，从而导致生长发育受损 。我们使用qRT PCR检测IGFBPs（igfbp1b、igfbp2a、igfbp6b、igfbp1a、IGFBP7和igfbp5a）的表达 。其中igfbp2a、igfbp6b和igfbp1a显著下调，igfbp7和igfbp5a稍微上调 。IGFBP-1是一种与IGF团结的渗透卵白，在调理体细胞的生长、发育和朽迈中起着至关主要的作用 。qRT-PCR效果批注斑马鱼中igfbp1a的转录水平显著下调，批注IPPD袒露后斑马鱼的生长发育受到抑制 。斑马鱼IGFBP-2是一种对IGF-I和IGF-II（而非胰岛素）具有高度亲和力的基因编码卵白，在体外可抑制IGF诱导的细胞生长 。本研究中视察到的igfbp2a的显著下调批注IPPD对斑马鱼的早期胚胎发育造成倒运影响 。研究批注，IGFBP6s（igfbp6a和igfbp6b）是一种抑制性卵白质，可能通过团结IGF抑制IGF在体内的作用 。在腾博会官网研究中，igfbp6b转录水平的下调可能会影响IGF的正常功效 。腾博会官网效果批注，袒露于IPPD后，加入GH/IGF轴的基因表达受到滋扰，这可能导致斑马鱼胚胎的生长抑制 。
袒露于IPPD的HPT轴响应：在脊椎动物中，除GH/IGF轴外，HPT轴在生长发育历程中也起着主要作用，认真维持正常的甲状腺激素浓度 。HPT轴功效的改变会影响新陈代谢、渗透调理和发育 。在本研究中，袒露于IPPD后，斑马鱼仔鱼的全身THs（T4和T3）水平降低 。腾博会官网效果批注，袒露于IPPD可滋扰体内甲状腺激素 。IPPD破损了斑马鱼仔鱼的甲状腺系统 。qRT-PCR检测HPT轴相关基因的表达 。甲状腺滤泡中T4和T3的合成和释放受垂体促甲状腺激素（tsh）的控制 。在哺乳动物中，促甲状腺素释放激素（trh）或促肾上腺皮质激素释放激素（crh）是tsh的主要调理者，而在硬骨鱼中，tsh的渗透由crh调理 。因此，crh和tshβ的下调可能与甲状腺激素含量降低有关 。因此，本研究中视察到的仔鱼全身总甲状腺激素（T4和T3）含量的降低可能是由于crh和tshβ表达下调所致 。碘甲状腺原氨酸脱碘酶 (dios) 认真甲状腺激素的激活和失活，甲状腺激素在脊椎动物的循环和外周 THs 水平中起着要害调理作用 。以往的研究批注，脱碘酶的转录水平是袒露于情形污染物的鱼类甲状腺破碎的敏感分子生物标记物 。THs在维持脊椎动物的正常心理运动中施展着主要作用，THs与肝脏、眼睛和生殖器官等种种器官中的甲状腺激素受体（thrα和thrβ）团结并激活，从而诱导心理运动和行为 。腾博会官网研究效果批注，在差别浓度的 IPPD 处置惩罚后，thrα 和 thrβ 的表达水平显著下调，这可能会导致斑马鱼仔鱼的生长抑制和发育障碍 。氧化应激也会影响水生生物的生长、生涯和发育 �？寡趸烙低秤擅负头敲敢蛩刈槌� 。 酶系统包括超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)，而还原型谷胱甘肽 (GSH) 是主要的非酶抗氧化剂之一 。SOD和CAT活性的显著降低批注，袒露于IPPD后，斑马鱼仔鱼体内活性氧（ROS）和抗氧化系统之间的平衡被破损 。谷胱甘肽是一种主要的抗氧化剂，其含量可以反应细胞器的抗氧化能力 。谷胱甘肽含量的显著降低批注抗氧化剂的太过消耗，因此导致抗氧化防御能力的显著降低 。MDA是脂质过氧化的主要氧化产品 。 本研究中 MDA 天生的增添批注，袒露于 IPPD 后可诱导氧化应激 。 鉴于氧化应激与生长性能之间的关系，可以推断氧化应激是IPPD对生长的毒性作用之一 。
结论：腾博会官网研究批注，袒露于IPPD的斑马鱼胚胎体现出显着的生长抑制，并改变了GH/IGF的激素含量以及GH/IGF和HPT轴相关基因的表达水平 。我们可以推断，IPPD 诱导的生长抑制是由 GH/IGF 和甲状腺内渗透系统破损的综相助用造成的 。别的，IPPD的处置惩罚显著影响斑马鱼胚胎的抗氧化状态，其机制需要进一步研究 。鉴于IPPD作为橡胶抗氧化剂的普遍使用，其残留物保存于情形中，需要进一步研究，以评估IPPD单独或与其他化学品组合使用对鱼类的恒久影响 。
原文出自：IPPD-induced growth inhibition and its mechanism in zebrafish - ScienceDirect
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