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摘要：斑马鱼是模拟人类疾病的主要动物系统。 这包括肾功效障碍，由于胚胎肾（前肾）与人类肾单位在分子和形态方面同源性高。肾病的一个要害临床指标是卵白尿，但现在缺乏斑马鱼卵白尿的高通量判读。为相识决这个问题，我们使用Tol2转座子系统天生了转基因斑马鱼系，该系使用fabp10a肝特异性启动子太过表达与受体相关卵白D3结构域融合的纳米荧光素酶分子（一种分子朋侪），我们称之为NL-D3，我们通过丈量胚胎作育基中的发光强度来定量NL-D3斑马鱼仔鱼的卵白尿。使用光度计，通过丈量胚胎作育基中的发光强度来量化 NL-D3 斑马鱼仔鱼中的卵白尿。在康健状态下，NL-D3 不会被倾轧，可是当用影响近端肾小管重吸收（顺铂、庆大霉素）或肾小球滤过（血管主要素 II、汉克斯平衡盐溶液、牛血清白卵白）的化学物质处置惩罚胚胎时，在鱼作育基中检测到NL-D3。类似地，与肾脏疾病相关的几种基因产品（nphs1、nphs2、lrp2a、ocrl、col4a3和col4a4）的缺失也诱导了NL-D3卵白尿。用卡托普利治疗缺乏col4a4的斑马鱼仔鱼（Alport综合征模子）可镌汰卵白尿。研究效果证实了NL-D3转基因斑马鱼作为一种稳健和可量化的卵白尿报告品系的使用。鉴于斑马鱼高通量检测的可行性，NL-D3转基因斑马鱼将允许筛选改善卵白尿的药物，从而优先思量进一步转化研究的候选药物。
要害词：Alport综合征 基底膜 肾小球 卵白尿 近端小管 IV型胶原 斑马鱼
卵白尿是肾脏疾病的主要临床指标。 使用尿液试纸，可以在几秒钟内确定尿液中是否保存卵白质。对尿液中卵白质分子巨细的进一步评估批注肾单位功效缺陷的位置。尿液中大卵白的保存批注肾小球滤过器功效杂乱，而低分子量卵白的保存则批注近端小管功效杂乱。斑马鱼是研究肾脏发育和疾病的盛行模式生物，但现在缺乏卵白尿的定量报告。胚胎斑马鱼发育出一个功效正常的前肾，其分子和结构与人类肾单位相似。前肾由单其中线融合肾小球组成，附着于双侧小管，沿其前后轴支解为差别的近端和远端区域。测定斑马鱼胚胎肾功效的最佳要领是使用差别分子量的荧光右旋糖酐来区分肾小球和近端小管功效障碍。荧光右旋糖酐对卵白质内吞的细胞机制没有特异性 ；这些要领是有用的，但它们不是定量的，且不可以高通量方法使用，不可特异性识别近端小管中巨卵白介导的内吞缺陷。斑马鱼转基因报告基因品系(fabp10a:?vdbp-mCherry) 使胚胎作育基能够被网络并检测低分子量卵白质。这一功效强盛的系统允许定量卵白尿作为近端小管中lrp2/巨卵白内吞途径功效障碍的判读。通过免疫荧光成像或酶联免疫吸附测定，报告近端小管功效障碍，以量化近端小管中的卵白摄取和卵白尿。这种遗传工具突出了转基因在斑马鱼中开发卵白尿报告基因的潜力。我们形貌了一种新的基于纳米荧光素酶（NL）的斑马鱼卵白尿报告基因。胚胎作育基中渗透的NL卵白在添加其底物荧光素后通过发光检测。使用这一新系统可以高通量方法测定近端肾小管和肾小球功效的转变。
体外重组 NL-D3 可被内吞：目的是开发一种转基因报告基因来研究斑马鱼前肾近端小管的内吞作用。近端小管内吞途径的一个主要组成部分是具有多个配体的600 kDa巨卵白受体。巨卵白的功效和加工依赖于受体相关卵白，该卵白包括与巨卵白具有差别亲和力的三维结构域。我们将大鼠受体相关卵白与NL融合。全长受体相关卵白-NL融合爆发巨细为58kDa的卵白。假设限制报告卵白的巨细有助于其通过肾小球毛细血管壁，因此我们将受体相关卵白的14 kDa D3结构域融合到NL的C端，以爆发NL-D3，其展望巨细为35.5 kDa。我们首先想确认 NL-D3 融合卵白可以报告巨卵白依赖性内吞作用。在大肠杆菌中表达重组 NL-D3，并疏散纯化卵白质。然后将重组NL-D3用于HEK293细胞的摄取实验，该细胞稳固表达截短的megalin。通过裂解细胞并丈量发光来丈量摄取，与用重组NL-D3孵育的比照HEK293细胞相比，用重组NL3-D3作育的HEK293-MmR4细胞具有约莫10倍高的摄取水平。比照HEK293细胞和HEK293-MmR4细胞在与NL孵育后均未显示发光。这些体外效果批注 NL-D3 与巨卵白团结并容易被内吞。
图1. NL-D3被巨卵白内吞途径摄取。
γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑马鱼：为了开发一种可行的近端小管内吞作用的体内报告者，我们转向斑马鱼模子。使用多功效 Tol2 基因转移系统天生转基因斑马鱼，在肝脏特异性 fabp10a 启动子的控制下表达 NL-D3。为了举行选择，转座因子在γ-晶体卵白启动子的控制下双重表达McHery。5-dpf的转基因的γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑马鱼（下文称为NL-D3）的全胚胎裂解物的发光比野生型胚胎高约100000倍。成年期NL-D3报告鱼疏散的血液中视察到类似的发光增添� ；拐闪苛顺赡昶谄鞴僮橹蠳L-D3的含量，肝脏的发光最多。转基因斑马鱼中NL-D3的肝脏特异性表达导致该报告物强烈释放到血管系统中。培育了多代NL-D3转基因斑马鱼，没有视察到对鱼类整体康健或寿命的任何影响。NL-D3斑马鱼和年岁匹配比照组肝脏的组织学剖析显示无显着转变。
NL-D3 胚胎检测近端小管功效障碍：为了测试 NL-D3 是否通过肾小球滤器并被前肾近端小管中的巨卵白内吞途径重吸收。近端小管对10 kDa荧光右旋糖酐的再摄取评分为正常、低或无。与比照组（n=40）相比，lrp2a的缺失足以严重镌汰近端小管中10 kDa荧光右旋糖酐的摄�。╪=39）。将4 dpf的lrp2a变体置于96孔板的1孔中，替换胚胎作育基，用光度计丈量胚胎作育基中的NL-D3含量。与每孔 1 个胚胎相比，每孔 3 个胚胎（n = 9孔）在发光丈量中爆发的变异性较小� ；拐闪苛�1小时、4小时、8小时和24小时取自lrp2a变体的胚胎作育基的发光（每个时间点n=9）。NL-D3 报告基因的迅速度足以在短短 1 小时后评估卵白尿，但比照和实验样品之间的疏散在 24 小时时最大。我们在所有的剖析中都使用了这个时间点。使用重组NL-D3天生的标准曲线，将从光度计获得的相对发光单位定量转换为NL-D3量（ng/ml）。lrp2a的缺失导致胚胎作育基中保存的NL-D3增添约29倍。另一种与近端小管内吞作用有关的基因产品是OCRL，致病性变体导致Lowe综合征，与低分子量卵白尿相关。我们还测试了靶向近端小管并诱导卵白尿的肾毒素的作用。庆大霉素温顺铂是 2 种公认的肾毒素药物，主要通过近端小管细胞殒命引起肾脏损伤，以前曾用于消融斑马鱼近端小管上皮。胚胎作育基中 NL-D3 渗透的剖析批注，与赋形剂比照相比，0.5 nl 6 ng/μl 庆大霉素使卵白尿增添约 13 倍。用双倍量的庆大霉素处置惩罚胚胎使卵白尿进一步增添至比照（n = 12）的约 534 倍，批注在 NL-D3 报告基因中可检测到剂量反应。顺铂也获得了类似的剂量反应，低剂量（0.5mM）导致卵白尿增添约1.5倍，高剂量（1.5mM）引起约6.7倍。这些效果证实了NL-D3转基因鱼是一种可行的工具，用于检测近端肾小管功效障碍引起的卵白尿。
图 2. NL-D3 斑马鱼可用于检测近端小管功效障碍。
NL-D3胚胎检测肾小球功效障碍：我们进一步剖析了滋扰肾小球特异性基因表达的影响，以确定 NL-D3 报告基因是否也可用于丈量与肾小球功效障碍相关的卵白尿。NPHS1 和 NPHS2 编码建设足细胞裂孔隔膜的卵白质。这些基因的致病性变异导致肾病综合征，其特征是卵白尿过多。使用与 Fukuyo 等人使用的相同的吗啉代寡核苷酸，我们视察到 500 kDa 异硫氰酸荧光素缀合的葡聚糖从脉管系统中扫除，证实吗啉代会导致肾小球功效障碍。这些效果批注，NL-D3报告基因作为肾小球和近端肾小管功效障碍的双重报告基因。对斑马鱼前肾肾小球发育的透射电子显微镜剖析批注，在约莫 4 dpf 时建设了完全形成的过滤屏障。前肾小管的分解早于此，受精后48小时泛起刷状边沿和近端-远端支解。测试了NL-D3报告基因是否可以在早期发育阶段用于检测与近端小管功效障碍或肾小球功效障碍相关的卵白尿。发明在比照组（n=20）、nphs1变体（n=16）、lrp2a变体（n=12）或ocrl变体中，在24和48 hpf之间的报告者中均未检测到肾小管或肾小球相关卵白尿。
图3.NL-D3斑马鱼也可用于研究肾小球疾病。
斑马鱼colIV基因的表达剖析：鉴于与肾小球病理相关的肾脏疾病过多，NL-D3斑马鱼系丈量肾小球功效障碍的潜力令人感兴趣。其中一种情形是阿尔波特综合征，由人类COL4A3、COL4A4或COL4A5的变异引起。COL4A3、COL4A4或COL4A5的变体导致GBM中胶原a3a4a5（IV）镌汰或缺失，影响其恒久功效。阿尔波特综合征患者最初泛起微量血尿，随后泛起卵白尿，肾功效逐渐下降，导致肾衰竭。斑马鱼肾小球中 IV 型胶原卵白链的表达谱以前没有被表征过。 斑马鱼有 6 个 IV 型胶原基因 col4a1-a6，它们是人类中发明的 6 个 IV 型胶原基因 (COL4A1-A6) 的直系同源物。举行了原位杂交以检测4dpf斑马鱼胚胎中col4a1–a6转录物的空间组织，这是肾小球完全发育的时间点。预期col4a1和col4a2的表达谱是相同的，由于脊椎动物IV型胶原基因的表达是通过col4a1/col4a2、col4a3/COL4B4和COL4B5/COL4S6的假定双向启动子调控的。在血管系统中检测到 col4a1 和 col4a2 转录物，最显著的是在自动脉弓、中央动脉和头部区域的原始后脑通道中。在横切胚胎中清晰地视察到 col4a1 的肾小球定位。与 col4a1 和 col4a2 相比，col4a3 和 col4a4 表达谱受到更多限制。在晶状体囊和肾小球中视察到col4a3和col4a4的高水平表达，在鳃弓中检测到弱表达。使用原位杂交，我们无法检测肾小球中col4a5的表达，只管使用了差别的探针。
图4. 斑马鱼肾小球中表达IV型胶原
鉴于斑马鱼 NL-D3 转基因报告系可用于检测肾小球功效障碍，其中卵白尿是要害临床特征，例如在 Alport 综合征中，我们接下来实验使用化学要领拯救肾小球滤过以确定该系统用于复合筛选的潜力。col4a4 crispants被用作阿尔波特综合征的模子。对3 dpf至5 dpf的col4a4 crispants施用卡托普利来降低全身血压，我们测定了4 dpf至5dpf的卵白尿� ？ㄍ衅绽且恢盅苤饕刈幻敢种萍�，以前曾用于斑马鱼以降低血压。假设降低全身血压也会降低肾小球内压。我们发明卡托普利治疗对未注射的斑马鱼胚胎没有影响，但险些完全避免了col4a4 crispants的卵白尿。使用2,3-丁二酮2-单肟降低3 dpf至5 dpf斑马鱼胚胎的心率。假设较低的心率会导致肾小球灌注镌汰，从而镌汰肾小球滤过。野生型斑马鱼胚胎剂量反应剖析批注，浓度为7.5μM的2,3-丁二酮2-单肟足以显著降低心率。血管主要素 II 是一种肽激素，可通过诱导血管缩短来增添血压。发明 0.5 μM 血管主要素 II 不会导致 NL-D3 胚胎泛起卵白尿 ； 然而，5 μM 血管主要素 II 导致卵白尿增添约 3.4 倍（n = 12）。注射 Hanks 平衡盐溶液或 10% 牛血清白卵白会导致 NL-D3 报告胚胎中的卵白尿急剧增添。汉克斯平衡盐溶液是一种盐水溶液，注射时会导致水流入血管系统，并已被证实会扩张肾小球毛细血管。假设注射 Hanks 平衡盐溶液会在肾小球中爆发急性机械负荷从而导致卵白尿。，我们视察到 500 kDa 荧光素异硫氰酸酯共轭葡聚糖的扫除率增添支持这一点。我们检测到Hanks平衡盐溶液注射的 NL-D3 胚胎发光增添了约莫 128 倍。这些数据证实NL-D3报告系可以检测与全身血压和肾小球灌注转变相关的卵白尿。他们还强调了这一新工具在肾功效治疗筛查中的潜力。
结论：腾博会官网数据显示了基于 NL 的斑马鱼品系卵白尿报告基因的开发。 鉴于该系统在实验可用性和高通量筛选的可行性方面的优势，预计这种新的卵白尿报告基因将成为肾脏研究职员工具包的名贵增补。
原文出自：A novel nanoluciferase transgenic reporter measures proteinuria in zebrafish - ScienceDirect
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