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小鼠基因组定点编辑手艺

• ES细胞打靶手艺

• CRISPR/Cas9手艺

ES细胞打靶

在小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）中举行 DNA 同源重组
，将 ES 细胞重新注射到囊胚腔中
，可以形成嵌合胚胎
，并能在假孕小鼠体内发育
，最终发育为嵌合体小鼠。这种嵌合小鼠的组织细胞（包括生殖细胞）可以划分来自囊胚的细胞和被注射的ES细胞。因此
，通过嵌合小鼠和野生型小鼠的交配
，ES 细胞中的遗传信息就能够转达到子女的小鼠个体中。

使用ES细胞打靶手艺建设基因修饰小鼠模子的主要手艺蹊径：

（1）构建重组基因载体（正负双向选择系统）

（2）用电穿孔等要领把重组DNA转入受体ES细胞内

（3）用选择作育基筛选抗药ES细胞
，并使用PCR或或 Southern blot 等要领判断爆发准确同源重组的ES细胞

（4）将中靶ES细胞注射到受体囊胚中
，将注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宫中
，让其受孕
，待小鼠出生后
，通过视察毛色的嵌合与否和嵌合水平判断是否获得嵌合体小鼠。

CRISPR/Cas9手艺

CRISPR/Cas是细菌和古细菌在恒久演化历程中形成的一种高度守旧的顺应性免疫防御系统
，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。

CRISPR是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（纪律成簇距离短回文重复）的缩写。CRISPR簇是一个普遍保存于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族
，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度守旧的重复序列区(Repeat)和多个距离区(Spacer)组成。

Cas则是在CRISPR周围的一个多态性家族基因
，这个家族基因编码的卵白均含有可与核酸爆发作用的功效域
，并且与CRISPR区域配合施展作用
，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)
，缩写为Cas
，包括Cas1～Cas10等多种类型。

当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时
，在前导区的调控下
，CRISPR被转录成pre-crRNA
，然后被加工成一系列短的含有守旧重复序列和距离区的成熟crRNA
，最终识别并团结到与其互补的外源DNA序列上施展剪切作用。

使用CRISPR/Cas9系统的这些特征
，CRISPR/Cas9途径获得基因修饰小鼠模子的主要手艺蹊径：

（1）我们可以针对基因组特定序列设计向导RNA（gRNA）

（2）体外转录gRNA以及编码Cas9卵白的mRNA

（3）将gRNA、Cas9 mRNA注射到小鼠受精卵中

（4）注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中
，受精卵发育成F0代小鼠。

扩展阅读——正负双向选择系统 (positive-negative-selection, PNS)

由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然爆发同源重组的机率很是低
，约为百万分之一
，要把基因敲除乐成的细胞筛选出来是一件很是难题的事情。因此
，需要借助一些筛选标记来解决这一要害问题。

“+” 正筛选标记：通常是药物抗性基因
，最常用的就是Neo（新霉素抗性基因）。通过构建打靶载体
，将带有目的片断的外源DNA序列连同正筛选基因 neo 通过 DNA 序列间的同源重组替换基因组中需要敲除或修饰的片断
，抵达敲除或敲入特定基因的目的。正筛选基因 neo的表达付与重组 ES 细胞具有对抗细胞毒性药物 G418的特征
，使细胞在药物筛选下存活并形成细胞克隆。

“-” 负筛选标记：为镌汰因随机插入爆发的药物抗性克隆对筛选的滋扰
，可以在打靶载体同源重组区域的外侧加上负筛选基因
，通常是细胞毒性相关基因。例如来自疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因
，该基因可以将对细胞无毒的核苷类似物 Ganc 举行磷酸化
，从而爆发对细胞有毒的核苷酸类似物。 当打靶载体在细胞内举行同源重组时
，TK 基因由于在同源重组区域的外侧
，因此不会整合到细胞染色体上
，随着细胞的生长和破碎 TK 基因爆发自然降解和稀释
，从细胞中消逝。因此这类细胞不会由于 Ganc 的保存而死。但若是爆发打靶载体随机插入整合到 ES 细胞染色体上的情形
，那么TK 基因很可能也会同时整合上去
，效果导致这类非准确同源重组的ES细胞在 Ganc 的保存下天生有毒的核苷酸类似物而致死。