更新时间：2019-01-22, 泉源：国家实验动物专家委员会简报 2019年第6期2062
与基因工程小鼠等动物制备相比 ，遗传修饰NHP动物保存制备效率、操作难度、研究本钱等多个瓶颈。以至于致在转基因小鼠出生后近20年后 ，才获得天下上首例绿色荧光卵白转基因猴[23]。可是 ，ZFNs、TALENs和CRISPR/cas9等高效基因编辑手艺的成熟和应用 ，促使NHP基因编辑动物制备进入了快车道 ，亨廷顿舞蹈病、帕金森病、抑郁症等NHP疾病动物模子相继降生[24,25]。
可是 ，对糖尿病而言 ，现在尚无相关NHP基因工程动物制备的研究报道。我们以为 ，制备基因工程NHP糖尿病模子动物可能保存以下几方面限制：一是临床发明 ，90%以上2型糖尿病患者体现为基因表达改变而非基因编码改变[26-28] ，虽然已证实某些T2DM患者的单基因突变是致病缘故原由 ，但点突变患者在T2DM发病人群中的比例较低 ，因而基于该突变位点制备的基因工程动物在临床上的代表性存疑；二是人们使用全基因组关联剖析（Genome-wide association studies, GWAS）在T2DM上发明了100多个关联SNP[26-28] ，显然要对云云多的DNA位点举行遗传操作 ，现在还保存手艺难题。别的 ，灵长类动物的世代距离长（5~6年） ，且为单胎 ，纵然获得了能稳固遗传的糖尿病模子小样本 ，凭证小鼠模子培育需要8~10代[29]盘算 ，种群培育的漫长周期 ，使得该途径的可行性和适用性也大受影响。
（四）糖尿病易感NHP种群的筛选和建设
临床盛行病学视察发明 ，关于糖尿病遗传家族人群 ，若是合理饮食及运动 ，可能镌汰疾病爆发；相反 ，非糖尿病敏感人群 ，若是恒久摄入高糖、高脂食物 ，且不注重运动等运动 ，也可能增添患病危害。也就是说 ，糖尿病是遗传因素和情形因素配相助用的效果[26-28]。凭证糖尿病的上述特征 ，现在培育的糖尿病模子动物种群（如kkay小鼠、DZF大鼠等）主要通过表型选育获得。
正如前面上述 ，NHP自然发病动物多为中晚年 ，且兼具世代距离长和单胎等特点 ，表型选育难以形成稳固遗传的种群。
最近 ，我们实验室使用人T2DM的遗传数据 ，通过生物信息学挖掘——基因组映射——特定靶点高通量测序这一崭新途径 ，获得了猴T2DM关联SNP；建设了猴T2DM遗传危害评估模子；筛选建设了T2DM易感猴繁育种群。
首先 ，使用人T2DM的遗传数据 ，通过生物信息学剖析 ，挖掘到可强人T2DM关联的基因组片断276个 ，将其映射到食蟹猴基因组。接纳平衡病-健小样本（82/85）对上述特定靶点举行高通量测序 ，获得与T2DM关联的SNPs共99个。使用99个关联SNPs建设猴T2DM遗传危害评估模子 ，模子的展望效果与动物现实表型一致性为79.64%（133/167）；而以关联水平最高的30个SNPs举行T2DM危害评估 ，其效果与99个SNPs基本一致。
进一步对两种遗传展望模子的危害系数举行统计剖析 ，效果发明 ，当危害系数在0.4~0.6之间时 ，展望效果与动物现实表型差别较大（一致性约为62%~65%）；而当危害系数≤0.4或者≥0.6时 ，展望效果与动物现实表型的一致性显著提高（大于80%）�；谏鲜鐾臣菩Ч� ，我们提出了T2DM易感猴的评价标准为：对99个SNPs位点举行测序 ，当99-SNPs和30-SNPs的危害系数同时≥0.6 ，该动物为T2DM易感个体；当两种模子获得的危害系数同时≤0.4 ，该动物为T2DM不敏感个体。使用该标准对所测试的167只猴举行剖析 ，展望效果与现实表型的一致性凌驾85%。
最后 ，从所测试的表观正常猴中挑选T2DM高危害动物8只、中度危害动物6只（99-SNPs或30-SNPs的危害系数为0.4~0.6）和低危害动物13只 ，同时饲喂高能量饲料32 w。高危害动物在20 w左右最先泛起高血糖表型 ，最终6只猴泛起糖尿病病变（75.0% ，6/8） ，1只猴虽然血糖值仍在正常水平 ，但糖耐量受损（12.5% ，1/8） ，而另1只猴糖代谢正常（12.5% ，1/8）；6只中度危害动物 ，1只泛起糖尿病病变（16.7% ，1/6） ，3只仅体现糖耐量受损（50.0% ，3/6） ，2只动物糖代谢正常（33.3% ，2/6）；而13只低危害动物 ，糖代谢所有正常。
现在 ，课题组测试了334只中青年滋生猴 ，获得了86只（在猴群中的比例为25.75%）T2DM遗传高危害猴（即99-SNPs和30-SNPs危害系数同时≥0.6的动物）。其中雌性75只 ，雄性11只 ，凭证牝牡动物SNP位点的基因型 ，86只T2D高危害猴组成了10个滋生单位。
关联SNP研究以及遗传危害筛选为T2DM等重大遗传性疾病NHP模子动物种群建设提供了新途径 ，但种群的遗传稳固性还需要子女表型剖析支持�？翁庾榻凳倍訲2DM敏感猴群的子女举行测试 ，以磨练该要领的可靠性。
三、非人灵长类动物糖尿病模子种群的标准化研究
与人T2DM发病历程一样 ，NHP动物在疾病差别阶段展现差别特征 ，到疾病后期 ，因高糖损伤而导致的心脑血管系统、肾脏组织等综合症将直接威胁到动物生命。因此 ，猴群按期监测、饲养标准、发病动物照顾护士是种群标准化研究的主要内容。
（一）NHP糖尿病模子种群监测
1、空腹血糖：只管一直有T2DM新的诊断指标被报道 ，但空腹血糖值仍然是糖尿病最直接的诊断标准。对人而言 ，WHO标准为：当空腹血糖≥7.0 mmol/L时为显性糖尿��；餐后2 h血糖值>7.8 mmol/L时 ，为糖耐量受损。
而猴子等NHP动物的血糖值现在尚无统一标准。对正常猴与康健人群的血糖值较量发明 ，NHP动物的血糖值通常较人低1.0~1.77 mmol/L。因此 ，猴的空腹糖>5.6 mmol/L时 ，即可能患病[30]。但也有研究报道以为 ，以人的指标（即空腹血糖≥7.0 mmol/L）作为猴糖尿病依据更准确[20]。
与人差别的是 ，动物的空腹血糖容易受操作历程影响。好比强烈的保定操作以及镇痛剂都可能导致血糖值异常波动。关于猴子等NHP动物 ，现在主要接纳两种要领确认动物的现实血糖值。一是差别时间点的测定效果较量；二是使用对血糖险些没有影响的镇痛剂（如氯胺酮 ，剂量为10mg/kg体重）镇静后测试[31]。
另外 ，猴子等NHP动物的空腹时间也有别于人和其他动物。猴等NHP动物口腔两侧有颊囊结构 ，摄食时部分食物首先贮存于颊囊中 ，然后在返回口腔品味消化。因此 ，在测定猴子等NHP的空腹血糖时 ，动物禁食时间较人和无颊囊动物长[20]。
我们重复较量了猴的空腹血糖测定 ，获得了较为稳固的效果。程序如下：猴禁食（不禁水）13~14 h；用10mg/kg体重氯胺酮肌肉注射麻醉；15~20min后采后肢静脉血1.5~2.0mL；离心网络血清；在生化仪上测定血糖值。
别的 ，在测定动物血糖值时 ，经常用血糖试纸条测定全血。我们在实验中发明 ，全血的血糖值通常较血清低0.3~0.7mmol/L。
2、糖耐量试验：与血糖值相比 ，糖耐量试验被以为是糖代谢正常与否的金标准。在人上 ，糖耐量试验包括口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test ，OGTT）和静脉注射葡萄糖耐量试验（intravenous glucose tolerance test ，IVGTT）两种方法。
但关于NHP等动物而言 ，糖耐量试验主要接纳IVGTT要领 ，以利于准确控制葡萄糖用量。我们对Bremer等[20]报道的要领举行了刷新 ，即猴禁食13~14 h；肌肉注射麻醉氯胺酮10mg/kg体重；划分在镇痛剂注射后10~15min、20~25min采后肢静脉血两次 ，每次1.5~2.0mL；第二次采血后 ，同时静脉注射50%葡萄糖溶液1.2mL/kg体重；划分在葡萄糖注射后5、10、15、30、60、90、120、150min取后肢静脉血1.5~2.0mL；离心获得血清 ，测定血糖值和血清胰岛素。盘算血清葡萄糖曲线下面积（Area under the curve of glucose tolerance test）、血清胰岛素曲线下面积（Area under the curve of blood insulin）、胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index ，ISI）。凭证上述指标 ，可判断种群中差别动物所处的发病时期。
3、其他理化指标：除血糖和糖耐量试验外 ，对种群按期监测还包括以下指标：血清胰岛素、C反应卵白、糖化血红卵白、血脂（总胆固醇、HDL-C、LDL-C、TG、apoA1、apoB、apoC3等）、脂肪细胞激素（脂联素、瘦素等）、促炎标记物（CRP、MCP-1、PAI-1中分子）、体重（包括体重指数）、摄食量。虽然这些指标不是糖尿病的焦点诊断标记 ，但可为动物的病程判断和划分提供有益资助。
理论上 ，血清胰岛素、C反应卵白和糖化血红卵白关于糖尿病诊断有较高的价值和意义。但我们在猴研究中发明 ，血清胰岛素波动幅度太大 ，相反C反应卵白和糖化血红卵白又不敏感 ，不适相助为猴等NHP动物糖尿病的主要标记。
（二）NHP糖尿病模子种群饲养标准
高糖高脂饲料目今普遍应用于糖尿病模子动物制备 ，关于猴等NHP动物而言 ，现在已有商品化的高能量饲料。Bremer等[31]在饲喂商品化高能量饲料的同时 ，特殊给予猴饮用含果糖（75g/天/只）的饮料 ，最终29只恒河猴饲喂一年后 ，4只猴生长成为显性糖尿�。ǹ崭寡侵怠�7.0 mmol/L） ，其余25只都体现代谢综合症的某些特征。
我们前期在T2DM遗传高危害猴的诱导实验中 ，凭证动物营养需求、食物适口性、饲料坚硬度等指标 ，最终组成了如下高能量饲料配方：基础全价饲料55%；牛油25%；蔗糖7.0%；果糖7.0%；胆固醇1.0 %；酪卵白3.0%；微量元素1.5%；复合维生素0.5%。使用该高能量饲料 ，动物最早在20 w即泛起显性糖尿病表型（空腹血糖值≥7.0 mmol/L） ，饲喂32 w ，8只T2DM遗传高危害猴有6只生长成为糖尿病。
而接纳食物摄入量限制等步伐 ，不但延伸了糖尿病猴的寿命 ，并且显着影响猴糖尿病的历程和并发症的爆发。
这些研究批注 ，凭证现实需求调解猴等NHP模子种群的饲料标准 ，既可镌汰动物自己的疾病痛苦 ，又能包管名贵资源的最大使用。
（三）NHP糖尿病动物的照顾护士
与人一样 ，猴等NHP动物一旦确诊为糖尿病 ，需要对发病动物举行全心照顾护士 ，避免动物意外殒命 ，控制糖尿病性肾病、糖尿病性心血管系统疾病、糖尿病性眼病、糖尿病性周围神经病变等并发症。
Hansen等凭证多年的研究效果 ，总结了一套糖尿病猴及其并发症的照顾护士计划。其焦点内容包括：（1）当猴首次被确诊为糖尿病时 ，动物体重将逐渐下降 ，此期若是不需要控制病情生长 ，动物不需要药物处置惩罚。（2）若是早期需要治疗 ，可给动物口服二甲双胍等、PPAR激动剂、吡格列酮等降糖；二甲双胍用量为500~1000mg/天/只 ，若是动物血糖值仍然处于高位 ，二甲双胍可加倍使用；二甲双胍通�？稍谝荒昊蚴昴谀苡杏每刂品⒉《锾逯叵陆岛筒⒎⒅⒈�。（3）关于发病2~3年（也许时间更长）的动物 ，口服药物效果不佳 ，特殊是动物泛起高血糖（摄食后3~5 h血糖值凌驾160mg/dL）、体重急剧下降、尿糖和尿卵白显着增添等临床体现时 ，可给予胰岛素治疗；最好选用长效胰岛素 ，初始剂量为1~2IU/只 ，也可凭证动物的血糖控制情形 ，调解胰岛素用量。（4）当动物恒久疾病而泛起低血糖（35mg/dL）体现时 ，通�？赡苁怯捎谑褂昧艘鹊核� ，或者动物摄食量显着镌汰所致；照顾护士上可通过提高食物和饮料的适口性增添动物摄食 ，也可通过胃管和静脉注射等方法增补葡萄糖 ，直到动物的血糖值抵达120mg/dL以上；低血糖猴的治疗计划与患者完全相同 ，若是需要 ，甚至可给予胰高血糖素。
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